4 استراتژی اسکرین کردن انتقال ژن

 

🧬مبحث: بیوتکنولوژی 📝مقاله قبلی: معرفی انواع بیوراکتورها برای کشت سلول‌های معلق و چسبنده 📝مقاله بعدی:ژن درمانی; پیش قدم در حذف بیماری‌های ژنتیکی 💻مدرسه تکمیلی: مدرسه مقدماتی و پیشرفته بیوتکنولوژی 🖊شماره مقاله: 15

گاهی پیدا کردن کلون درست که با موفقیت ژن مورد نظر ما را دریافت کرده است، مثل پیدا کردن سوزن در انبار کاه است!

شاید شما راه حل‌های خلاقانه‌ای برای این ضرب المثل قدیمی داشته باشید مثلا بخواهید با یک آهن‌ربا قوی شانستان را امتحان کنید. خوشبختانه دانشمندان هم راه‌های خلاقانه خودشان را برای پیدا کردن سلول‌های دریافت‌کننده ژن پیدا کرده‌اند.

درست است که در طرح وکتور استراتژی‌های انتخابی مثل قرار دادن ژن یک آنتی‌بایوتیک رعایت می‌شود که به ما کمک می‌کنند اما گاهی این به تنهایی کافی نیست و باید از استراتژی‌های اسکرین کردن نیز استفاده کنیم.

اسکرین کردن یعنی شما بتوانید با مشاهده مشخص کنید، کدام کلونی ژن شما را دارد و کدام ندارد. برخلاف روش‌های انتخابی که با مرگ سلول‌های نامناسب همراه هستند، در اسکرینینگ شما فقط آگاه می‌شوید و سلولی کشته نمی‌شود.

این کار به شما کمک می‌کند تا راحت‌تر به کلونی مطلوب خود برسید. در ادامه این مقاله با روش‌های اسکرین کردن انتقال ژن آشنا می‌شویم.

یک راه کلاسیک: سفید خوب و آبی بد

یک راه کلاسیک و پراستفاده اسکرین آبی-سفید است. به زبان ساده در این روش شما به کلونی‌های موجود نگاه می‌کنید: کلونی‌های سفید ژن را دریافت کرده‌اند و کلونی‌های آبی دنای مورد نظر شما را دریافت نکرده اند.

این روش چطور کار می‌کند؟

این روش بر ژن lacZ تکیه دارد. این ژن آنزیم β-galactosidase را کد می‌کند و بیان آن به لاکتوز و IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) وابسته است. آنزیم β-galactosidase باعث شکستن X-gal به گالاکتوز و یک رنگدانه نامحلول آبی می‌شود.

حال که منشا رنگ آبی را فهمیدیم باید ببینیم چرا سلول‌های مد نظر ما سفید رنگ هستند.

دانشمندان کشف کرده اند که اگر بخشی از ژن lacZ حذف شود، جهشی تحت عنوان lacZΔM15 رخ می‌دهد که نتیجه تولید بتا گالاکتوزیدازی است که کارکردش را از دست داده است.

حال سلولی با این جهش را در نظر بگیرید، اگر بخش حذف شده (α-peptide DNA) در پلازمید موجود باشد، عملکرد درست آنزیم باز می‌گردد و کلونی آبی رنگ خواهد بود. اما اگر شما ژن مورد نظر خود را در میان توالی پلازمید اضافه کنید، عملکرد آنزیم مختل شده و کلونی سفید رنگ خواهد بود.

🖊برای مطالعه بیشتر می‌توانید مقاله غربالگری سفید و آبی و پروتکل های انتخاب کلنی را مطالعه کنید.

نکاتی در مورد اسکرین کردن Blue-white

از آنجا که این روش بسیار پرکاربرد است بهتر است با برخی نکات آن هم آشنا شویم:

کنترل خوب قدم اول است: مطمئن شوید که تمام کلونی‌های شما قبل از انتقال آبی باشند تا کارکرد درست را نشان دهند.

عجله کار شیطان است: یک ظرف پر از کلونی‌های سفید زیاد خوشبینانه به نظر می‌رسد بین 16-20 ساعت به کلونی‌ها فرصت دهید تا آنزیم را بیان و x-gal را بشکنند.

از یخچال استفاده کنید: قرار دادن صفحات در دمای 4 درجه سانتیگراد برای چند ساعت پس از انکوباسیون اولیه شبانه، باعث افزایش رسوب رنگدانه‌ها و ایجاد تمایز بهتر بین کلونی های آبی و سفید می‌شود.

در تهیه پلیت خود مراقب باشید: X-gal به نور و دما حساس است و پس از اتوکلاو باید به محیط اضافه شود. اگر از پلیت آماده استفاده می‌کنید از توزیع درست مطمئن شوید و زمان کافی برای خشک شدن در نظر بگیرید.

گول مثبت‌های دروغین را نخورید: این روش نشاندهنده یک درج است و این الزاما ژن مدنظر شما نیست. هر ورودی که α-peptide DNA را مختل کند باعث بروز یک کلونی سفید خواهد شد.

موارد نادری از منفی‌های کاذب هم ممکن است رخ دهد. در مجموع بهتر است از این روش میزان سلول‌های مورد بررسی را محدود کنید و با روش دیگری مثل PCR فرآیند را تکمیل کنید.

از سویه مناسب E. coli استفاده کنید: سلول شما باید جهش lacZΔM15 را داشته باشد. برای مثال XL1-Blue, DH5α, DH10B, JM109, STBL4, JM110 قابل استفاده اند.

از پلازمید مناسب استفاده کنید: pGEM-T, pUC18 و pUC19  و pBluescript نمونه‌های معمول هستند.

راهی به خصوص: هضم با محدودکننده

این روش شامل دو مرحله است: 1. انکوباسیون دنا به همراه آنزیم‌های محدودکننده 2. اجرا واکنش روی ژل آگارز تا اندازه‌های مختلف دنا جدا شوند.

برای موفقیت این روش شما باید اندونوکلئازهای محدودکننده مناسبی را انتخاب کنید. بیایید با چند مثال کار را ساده کنیم:

1. اگر آنزیمی را انتخاب کنید که فقط یک بار دو طرف ژن درج شده شما را ببرد، 2 بند مشاهده می‌کنید که یکی ستون فقرات وکتور شما و دیگری ژن درج شده را نشان می‌دهد. اگر پلازمید شامل ژن منتقل شده نباشد فقط یک باند خواهید دید.
2. اگر آنزیمی انتخاب کنید که یک بار بین پلازمید را برش دهد و همراه با آن از آنزیمی استفاده کنید که فقط یک بار میان درج شما را برش دهد، در صورت وجود درج 2 بند و در غیر این صورت یک بند می‌بینید.

نکات و ترفندهای Restriction digest:

در اینجا تنها به نکاتی در مورد مرحله اول و انتخاب آنزیم مناسب می‌پردازیم.

آنزیم‌های منحصر به فرد انتخاب کنید: انتخاب آنزیم‌هایی که تنها یک نقطه را برش می‌زنند، تشخیص را برای شما راحت‌تر می‌کنند.

به سازگاری بافر و دما دقت کنید: وقتی که از چند آنزیم به طور همزمان استفاده می‌کنید، باید شرایط بهینه آنزیم‌ها را بررسی کنید تا بتوانند در کنار هم به درستی کار کنند.

مراقب شبیخون متیلاسیون باشید: برخی آنزیم‌ها مثل XbaI و ClaI نسبت به متیلاسیون حساس اند و ممکن است از فعالیت بیافتند.

از فعالیت ستاره‌ای دوری کنید: برخی از اندونوکلئازها به عنوان مثال (BamHI) می‌توانند توالی‌های شبیه به توالی‌ تشخیص خود را بشکنند. برای حل این مشکل می‌توانید از نسخه‌هایی با Fidelity بالا یا بافرهای به خصوص استفاده کنید.

یک راه سریع: PCR

غربالگری کلونی با واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، سریع‌ترین اسکرین اولیه برای تعیین وجود درج DNA است. این روش همان کار هضم با محدودکننده‌ها را با هزینه و زمان کمتر انجام می‌دهد.

مراحل کلیدی PCR کلونی به شرح زیر است:

1. طراحی پرایمر برای تشخیص حضور دنای درج شده
2. یک واکنش استاندارد PCR با استفاده از مایع رویی باکتری‌های لیز شده به عنوان الگو تنظیم کنید.
3. برای بررسی اندازه محصول، PCR را روی ژل اجرا کنید.

برای طراحی پرایمر 3 راه دارید که هر یک خوبی و بدی خود را دارند:

1. Insert-Specific: پاسخ بله یا خیر به وجود درج را می‌گوید اما مشخص نمی‌کند که آیا در پلازمید قرار دارد یا جای دیگر؟ تازه باید برای هر درج باید یک جفت پرایمر جدید بسازید.
2. Backbone-Specific: اطلاعات اندازه درج و وجودش در پلازمید را می‌دهد و می‌توان برای کلون‌هایی که پلازمید مشابه دارند هم استفاده شود. در مورد درج اطلاعاتی به شما نمی‌دهد.
3. Orientation-Specific: جهت‌یابی درج و وجودش در پلازمید را به شما اطلاع می‌دهد و برای کلونینگ blunt end عالی است. قسمت بد ماجرا این است که باید برای هر درج یک جفت پرایمر جدید بسازید.

نکاتی که در اسکرین کردن کلونی با PCR باید رعایت کرد

لقمه بزرگ‌تر از دهانتان بر ندارید: اگر تعداد زیادی باکتری به عنوان نمونه بردارید، ممکن است واکنش PCR مهار شود یا محصولات غیر اختصاصی روی ژل ظاهر شوند.

دوباره میگم گول مثبت‌های دروغین را نخورید: گرفتن اندازه مورد انتظار در محصول به تنهایی نمی‌تواند مشخص کند که جهشی در درج رخ نداده است. برای اطمینان چند نمونه کلونی مثبت را قبل از ادامه آزمایش، توالی یابی کنید.

امپلیکون‌های کوتاه‌تر بهتراند: برنامه PCR را برایتان کوتاه‌تر می‌کنند و احتمال عملشان در واکنشی که شامل بقایای باکتری است، بیشتر است.

از کنترل منفی استفاده کنید: در این کنترل از یک کلونی تغییر نیافته همان باکتری استفاده می‌کنید.  این کنترل برای insert-specific primer خیلی مهم است چون اگر کنترل منفی شما محصولی با اندازه مورد انتظار را تقویت می کند، می‌فهمید که ژنوم باکتری‌های شما از قبل دارای توالی هدف هستند.

از کنترل مثبت استفاده کنید: اگر این کنترل محصولی را تقویت نمی‌کند، می‌دانید که در تنظیم PCR و یا طراحی آغازگر یک مشکل دارید.

دقیق ترین راه: توالی یابی سنگر

در این روش اول دنای پلازمید را از کشت باکتری جدا می‌کنیم. بعد با استفاده از آغازگرهای توالی‌یاب (sequencing primers) مناسب وکتور، ژن درج شده را شناسایی می‌کنیم. برای اینکه توالی دقیق درج را تایید کنید، باید تمام آن را مشخص کنید.

گاهی پرایمرهای معمول تمام اطلاعات لازم را برای شما فراهم نمی‌کنند پس مجبور به طراحی پرایمر می‌شوید.

یک چیز که باید بدانید این است که توالی یابی سنگر معمولا می‌تواند 1 کیلوبایت DNA را مشخص کند. پس پرایمرهای سفارشی در نقش یک قهرمان برای تایید جهش‌هایی که با تعیین توالی از دو انتها مشخص نمی‌شوند، ظاهر می‌شوند.

در آخر

با روش‌های اسکرین کردن شامل اسکرین سفید-آبی، هضم با محدودکننده‌ها، PCR کلونی و توالی یابی سنگر آشنا شدیم. باید توجه کنید که بر خلاف استراتژی‌های انتخابی، در اسکرین کردن سلولی نمی‌میرد بلکه با روش‌هایی که گفته شد امکان تشخیص سلول تغییر یافته از دیگران فراهم می‌شود.

در زیست شناسی مولکولی، کلون‌سازی ژن در پلاسمید بیشتر وقت‌ها یک بازی با اعداد است. با استفاده از انواع تکنیک‌های غربالگری و انتخاب می‌توانید شانس یافتن کلون صحیح را افزایش دهید.