معرفی انواع بیوراکتورها برای کشت سلول‌های معلق و چسبنده

 

🧬مبحث: بیوتکنولوژی 📝مقاله قبلی: بهینه سازی متعادل Upstream و Downstream 📝مقاله بعدی: 4 استراتژی اسکرین کردن انتقال ژن 💻مدرسه تکمیلی: مدرسه مقدماتی و پیشرفته بیوتکنولوژی 🖊شماره مقاله: 14

تا مدت‌ها کشت سلول‌ها، محدود به سیستم‌های کوچک و تحقیقات پایه بود. جالب است که همزمان بیوراکتورهای بزرگ برای فرایندهای تخمیری استفاده می‌شدند.

⁉️ این سوال پیش میاد که چطور واکسن تولید می‌کردند؟

تا قبل از صنعتی شدن کشت سلول، چنین واکسن‌هایی با کشت سلول‌های اولیه در بطری‌های استوانه‌ای و در مقیاس کم تولید می‌شدند.

در دهه 1950، برنامه‌های واکسیناسیونی شروع شدند که نیازمند تکنیک‌های کشت انبوه سلول‌ها بودند. این نیاز، شروعی بود برای اصلاح تخمیر‌کننده‌ها تا‌ در صنعت دارو استفاده شوند.

در ادامه این مقاله قرار است با بیوراکتورهای مختلف و سیستم‌های استفاده از آن‌ها در فرآیندهای بالادستی آشنا شویم.

تفاوت تخمیرکننده‌ها و بیوراکتورها چیست؟

همانطور که در مقدمه هم گفته شد، تخمیرکننده‌ها به نوعی اجداد بیوراکتورهای امروزی هستند. اگر بخواهم دقیق‌تر بگویم، بیوراکتور اصلاح عمومی‌تری است که شامل فرمانتورها، همان تخمیرکننده‌ها، هم می‌شود.

هر دو دستگاه‌هایی هستند که شرایط کنترل شده‌ای را برای کشت و رشد سلول‌ها، تولید محصول و افزایش مقیاس فراهم می‌کنند.

فرمانتور اصطلاحی است که بیشتر در کار با باکتری، مخمر و قارچ استفاده می‌شود اما اصطلاح بیوراکتورها معمولا در استفاده از سلول‌های پستانداران (مثلا CHO، BHK و...) به کار برده می‌شود.

سلول‌های حیوانی حساسیت بیشتری نسبت به دیگر سلول‌ها دارند، به همین خاطر باید دستگاه‌ها برای رشد این سلول‌ها تغییر می‌کردند. مثلا باید در طراحی پروانه‌ها، نسبت ابعاد و روش اکسیژن رسانی، دوباره فکر می‌شد.

انواع مختلف بیوراکتورها 

فهمیدیم بیوراکتورها به طور کلی چه چیزی هستند، نوبت آن رسیده که با انواع آن‌ها و ویژگی‌های هر مدل آشنا شویم. به طور کلی می‌توانیم بیوراکتورها را به دو دسته تقسیم کنیم:

1. برای کشت سلول‌های معلق

بیوراکتور همزن‌دار (STR):

طراحی ساده و قدیمی این راکتورها باعث شده بیشترین کاربرد را در صنایع مختلف داشته باشند. ساختار عمومی این دسته بیوراکتورها را در عکس زیر مشاهده می‌کنید.

این نوع بیوراکتور خود می‌تواند به زیر دسته‌هایی تقسیم شود:

بیوراکتورهای میکروبی:

این گروه بیوراکتور باید انتقال خوب اکسیژن، سرعت و قدرت اختلاط بالا داشته باشند. برای تامین اکسیژن کشت، باید نسبت قد/قطر خاصی رعایت شود. حباب‌هایی در راکتور جریان دارند که در اثر برخورد با پروانه‌ها شکسته می‌شوند، این اتفاق سطح تماس گاز  را بیشتر می‌کند و اینطور اکسیژن‌رسانی بهتر می‌شود.

بیوراکتورهای کشت سلول:

این راکتورهای پر طرفدار در داروسازی، خطر آلودگی را کم می‌کنند، همزدن ملایم دارند و برای اینکه اکسیژن کافی در محیط باشد، از مخلوط گاز با جریان کم استفاده می‌کند. تنظیم pH این نوع راکتور با کمک کربن دی اکسید انجام می‌شود.

بیوراکتورهای یک بار مصرف (SUB):

این دسته که اخیرا بیشتر مورد توجه قرار گرفته اند، از قبل استریل شده اند و امکانات محدودتری دارند. این نوع راکتور در زمان آماده‌سازی و تمیزکردن صرفه جویی می‌کند و همچنین از آنجا که هر بار تعویض می‌شوند، خطر آلودگی کشت را کم می‌کنند.

این دسته در ابعاد مختلفی ارائه می‌شوند اما یک محدودیت 6000 لیتری دارند.

راکتورهای زیستی برای کاربردهای خاص (SSF و Photobioreactors):

دسته آخر بیوراکتورهای همزن‌دار، گروهی از ارگانیسم‌ها را کشت می‌کند که نیاز به شرایط خاص و غیر معمول دارند. برای مثال جلبک‌ها یا قارچ‌هایی که در محیط جامد رشد می‌کنند. این دسته بیشتر اوقات برای تهیه سوخت سبز استفاده می‌شوند.

بیوراکتورهای موج (wave bioreactor):

بیوراکتورهای موج همانطور که در تصویر می‌بینید، از یک کیسه پلاستیکی برای کشت استفاده می‌کنند، به همین خاطر از دسته بیوراکتورهای یکبار مصرف هستند.

در این نوع بیوراکتور، حرکات صفحه زیر کیسه کشت باعث ایجاد امواجی در محیط می‌شود. این مواج شدن هم به تهویه گازهای موجود در محیط کشت کمک می‌کند و هم از ته نشینی سلول‌ها جلوگیری می‌کند.

در شکل زیر یک نمونه ساختار این راکتور را می‌بینید:

بیوراکتورهای Airlift:

این دسته به خاطر کمبود اطلاعات رگولاتوری، در صنعت داروسازی خیلی کاربرد زیادی ندارند. بیوراکتورهای AirLift از جریان هوا برای مخلوط کردن محیط کشت استفاده می‌کنند.

موارد زیر، ملاحظات عمده در طراحی این راکتورها هستند:

1. پیکربندی هندسی
2. نسبت ابعاد
3. طراحی مسیر جریان هوا
4. موقعیت الکترودها
5. پورت‌های نمونه‌گیری، خوراک و...

2. برای کشت سلول‌های چسبنده یا آنکوریج

بیوراکتورهای همزن‌دار با Microcarrier :

ایده پشت این سیستم، این بود که یک واحد برای رشد سلول‌های وابسته به بستر طراحی شود که مثل یک راکتور سلول معلق، قدرت کنترل و افزایش مقیاس قوی داشته باشد.

در این روش ذرات جامدی به نام microcarrier در محیط کشت شناور هستند و اگر اوضاع وفق مراد ما پیش رود، سلول‌ها به آن‌ها متصل شده و در یک لایه رشد می‌کنند.

خواص شیمیایی و فیزیکی این حامل‌ها مثل اندازه، چگالی و شارژ سطحی برای ما اهمیت دارد. یک microcarrier باید غیرسمی، دارای پایداری مکانیکی، پایدار در pH عملیاتی، قابل اتوکلاو و در برابر تخریب میکروبی مقاوم باشد، چسبندگی خوبی داشته باشد و چگالی‌اش بین 1.03 تا 1.04 گرم بر میلی‌لیتر باشد. احتمالا خودتان حدس زده باشید که این چگالی برای تعلیق ذرات حامل در محیط کشت انتخاب شده است.

بیوراکتورهای بستر سیال (Fluidized Bed Bioreactors):

این دسته بیوراکتور، برای اولین بار توسط شرکت Verax در دهه 1980 معرفی شد. در آن نمونه سلول ها بر روی میکروسفرهای متخلخل رشد می‌کردند.این میکروسفرها از کلاژن ساخته شده بودند و برای افزایش وزن یک نوع استیل غیر سمی هم داخل خود داشتند. جریانی با سرعت بالا از کف دستگاه به سمت بالا وجود دارد که حامل‌ها را در حالت تعلیق نگه می‌دارد.

یکی از موضوعات دارای اهمیت انتخاب ریزحامل‌ها بود. پس تحقیقات مختلفی روی موادی مثل شیشه و پلی‌اتن صورت گرفت تا حامل‌های دیگری یافت شوند. مثلا حامل‌های Siran^TM ساخته شده از شیشه بوروسیلیکات بودند که به عنوان یک جایگزین ارزان‌تر وارد بازار شدند.

یکی از معایب این سیستم کم شدن اکسیژن در مسیر پایین به بالا بود که با ادغام مستقیم یک ماژول اکسیژن‌رسانی غشایی در بستر سیال قابل حل بود. یک راه دیگر برای حل این مشکل در موسسه میکروبیولوژی کاربردی وین، طرح شد. این راه جایگزین بر اساس گردش داخلی محیط کار می‌کرد و در ابعاد آزمایشگاهی و تولیدی با نام Cytopilot^TM وارد بازار شد.

در تصویر زیر مقایسه ساختار Cytopilot^TM و یک بیوراکتور بستر سیال مرسوم را می‌بینید:

بیوراکتورهای بستر ثابت (fixed Bed Bioreactors):

در بیوراکتورهای بستر ثابت یا بسته‌بندی شده، دانه‌های شیشه‌ای به عنوان بستر یا حامل انتخاب شده‌اند و در کنار هم به صورت ثابت قرار می‌گیرند.

البته باید توجه کنید که حامل‌های مختلفی برای این بیوراکتورها طراحی شده اند که الزما دانه‌های شیشه‌ای نیستند. مثلا Fibra-cel^TM که دیسک‌هایی از الیاف پلی‌استر است.

در مقاله مزایای دیسک‌های Fibra-Cel® برای کشت سلول می‌توانید بیشتر در این زمینه بخوانید.

این سیستم به عنوان جایگزینی برای بیوراکتورها با بستر سیال در شرایطی است که بخواهیم سلول‌ها را بی حرکت کنیم. محیط کشت برای تغذیه و هوادهی به سلول‌ها در بین الیاف/دانه‌ها گردش می‌کند.

حالت‌های عملکرد بیوراکتورها

3 حالت عملکردی برای بیوراکتورها در نظر گرفته می‌شود:

1.Batch و Fed batch:

در Batch سلول‌ها همراه محیط کشت در بیوراکتور ریخته می‌شوند تا وقتی که به چگالی سلولی بیشینه برسند. یعنی نقطه‌ای که به خاطر تراکم سلول‌ها، حداکثر محصول تولیدی و یا ضایعات زیاد باید سیستم را خالی کنیم و به Downstream بسپاریم.

در Fed batch تقریبا با همین روال روبرو هستیم اما برای افزایش مدت رشد و تولید سلول‌ها، در طول فرآیند، مدام مواد غذایی جدید وارد راکتور می‌شود. دوباره مثل Batch آنقدر ادامه می‌دهیم تا به نقطه بیشینه تولید برسیم و بعد همه محصول را با هم برداشت می‌کنیم.

2.Continuous:

در این حالت، به صورت مداوم محیط کشت جدید وارد راکتور می‌شود و همزمان سوسپانسیون سلولی خارج می‌شود، در نتیجه حجم ثابتی در بیوراکتور بر قرار است. یک نکته مهم در این نوع کشت این است که باید محتوا راکتور به خوبی مخلوط شود و غلظت محصول، متابولیت‌ها و سلول‌ها با جریان پساب برابر باشد.

کشت‌های مداوم ابزار خوبی برای تحقیقات و بررسی اثر شرایط مختلف بر کشت هستند اما برای تولید تجاری پروتئین‌های درمانی چندان مناسب نیستند. این خطر وجود دارد که پس از مدتی بیان پروتئین کاهش یابد همچنین تراکم سلولی کم باعث می‌شود، انتخاب خوبی برای تولید نباشند.

3.Perfusion:

نوع دیگری از کشت مداوم است که در آن سلول‌ها حفظ می‌شوند، محیط کشت جدید وارد و محیط قبلی بدون سلول با همان سرعت خارج می‌شود. در این نوع کشت به آرامی تراکم سلولی بیشتر می‌شود.

پرفیوژن پیچیده‌تر از کشت batch است و خطر آلودگی بیشتری دارد اما روشی پذیرفته شده برای تولید پروتئین‌های نوترکیب تجاری در مقیاس بالا است. از مزایای این روش می‌توان به این مسئله اشاره کرد که به خاطر تعویض مداوم محیط، دیگر اثرات منفی حاصل تولیدات جانبی سلول‌ها و بقایای سلولی را نخواهد داشت.

در آخر

با انواع مختلف بیوراکتورها و برخی ویژگی‌های آن‌ها آشنا شدیم و روش‌های مختلف کشت در آن‌ها را بررسی کردیم. در انتخاب بیوراکتور و روش کشت مناسب باید بررسی کنید که با چه سلولی کار می‌کنید و هدف فعالیت شما چیست؟ با توجه به هدف و شرایط خود می‌توانید بیوراکتور و شرایط مناسب را انتخاب کنید.

برای مطالعه بیشتر این کتاب را پیشنهاد می کنم: Cell Culture Technology For Pharmaceutical And Cell-Based Therapies