از زمانی که برای اولین بار توانستیم یک پیوند پپتیدی ایجاد کنیم بیش از 100 سال میگذرد اما اولین پپتیدها شامل اکسی توسین و انسولین تا 50-60 سال بعد سنتز نشدند! اگرچه این فرایند در گذشته پیچیده و دشوار بود اما امروزه با توجه به پیشرفتها شیمی پروتئین و توسعه روشهای تولید میتوانیم به راحتی پپتیدها را ایجاد کنیم.
مزیت استراتژیک سنتز پپتیدها در جهان امروز این است که به نمونههای بیولوژیکی محدود نیستیم و میتوانیم با استفاده از خلاقیت و تخیل خود پپتیدهای خاصی را طراحی و سنتز کنیم تا به یک پاسخ بیولوژیکی دلخواه برسیم.
در ادامه به بررسی کاربردها، فرآیند تشکیل، روشهای مختلف تولید و خالص سازی پپتیدها میپردازیم.
پپتیدهای مصنوعی چه کاربردهایی دارند؟
پپتیدها از صنایع دارویی تا کازمتیک کاربرد دارند. از زمانی که توانستیم پپتیدهای مصنوعی تولید کنیم، مناطق کاربرد مختلفی برای آنها ایجاد شدند از جمله:
👈 تولید آنتیبادیها با اپیتوپ مخصوص علیه پروتئینهای بیماریزا
👈 واکسن های پپتیدی
👈 مطالعه عملکرد، ویژگیها و شناخت پروتئینها
👈 مطالعه برهمکنش آنزیم-سوبسترا در گروههای مهمی مثل کینازها و پروتئازها با نقش اساسی در سیگنالینگ سلولی
👈 مطالعه اتصال گیرنده یا ویژگی شناسایی سوبسترا آنزیمهای تازه کشف شده با پپتیدهای سنتز شده همولوگ
👈 ساخت داروهایی علیه سرطان و سایر بیماریهای مهم
👈 استاندارد و معرف در طیفسنجی جرمی (MS)
👈 نقش اساسی در کشف پروتئینها مبتنی بر MS به خصوص نشانگرهای زیستی اولیه
👈 عوامل ضدپیری، پاکسازی، ضدالتهاب و... در محصولات کازمتیک
📝در مقاله بررسی محصولات پپتیدی در صنعت کازمتیک میتوانید بیشتر در مورد این کاربرد آخر بخوانید. |
فرآیند سنتز پپتیدها
در این بخش مراحل مولکولی را که طی میشود تا پپتید ساخته شود بررسی میکنیم؛ اگر به این بخش تئوری علاقه ندارید، مستقیم به بخش بعد بروید تا استراتژیهای تولید پپتیدها را توضیح دهیم.
[محافظت از پپتید : Peptide deprotection]
اسیدهای آمینه گروههای واکنش مختلفی دارند که میتوانند باعث واکنشهای جانبی نامطلوب شوند. برای آسان کردن سنتز پپتید و به حداقل رساندن واکنشهای جانبی، گروههای شیمیاییای ایجاد شده و به آمینواسیدها متصل میشوند تا گروه عاملیهای غیر اختصاصی را مسدود یا به اصطلاح محافظت کنند.
آمینواسیدهای منفرد با این گروههای محافظ قبل از سنتز واکنش میدهند و بعد از اتصال به آمینو اسید بعدی، گروههای محافظ به روی آن منتقل میشوند. بسته به روش سنتز میتوان از 3 نوع گروه محافظ استفاده کرد.
[جفت کردن اسیدآمینهها : Amino acid coupling]
برای جفت شدن مصنوعی پپتیدها باید کربوکسیلیک اسید C ترمینال آمینواسید ورودی را با کاربییمیدهایی مثل DCC یا DIC فعال کنیم. این مواد با کربوکسیل واکنش میدهند و یک واسطه بسیار واکنشپذیر ایجاد میکنند که به سرعت به آمین آمینواسید دیگر حمله میکند و پیوند پپتیدی جدید تشکیل میشود.
[شکافت پپتید : Peptide cleavage]
بعد از اینکه با تکرار چرخه مراحل قبل به زنجیره دلخواه رسیدیم، باید گروههای محافظتکننده را خارج کنیم. گروههای محافظتی با اسیدولیز شکسته شده و ماده مورد نیاز برای برش را با توجه به طرح محافظتی موجود، انتخاب میکنیم.
اگر این مرحله به درستی اجرا شود گروه محافظ N ترمینال آخرین امینواسید و C ترمینال آمینواسید اول به همراه هر محافظ جانبی موجود حذف خواهد شد.
استراتژیهای کلاسیک تولید پپتیدها
سنتز پپتید فاز مایع (LPPS)
سنتز پپتیدهای فاز مایع روشی کلاسیک است که دانشمندان هنگام کشف چگونگی تولید پپتیدهای in vitro از آن استفاده کردند و هنوز هم برای سنتز پپتیدهای کوتاه یا وقتی ایجاد تکیهگاه مناسب در فاز جامد آسان نباشد، در مقیاس بالا از آن استفاده میشود.
در این نوع سنتز بعد از هرمحله خالصسازی صورت میگیرد که باعث میشود بتوانیم به راحتی واکنشهای جانبی را تشخیص دهیم. همچنین برای حل مشکل ساخت پپتیدهای طولانی میتوانیم قطعات کوچک را سنتز کنیم و در نهایت به جفت سازی قطعات به پپتیدهای بزرگتر برسیم.
سنتز پپتید فاز جامد (SPPS)
بروس مری فیلد سنتز فاز جامد را معرفی کرد که حذف عوامل ناخواسته مثل حلالها و واکنشدهندهها بسیار ساده کرده است. این فرآیند به راحتی قابل اتوماسیون است که نتیجه اش تبدیل آن به روش اصلی سنتز پپتیدهای مصنوعی است.
در ابتدا از محافظت N-α-Boc برای آمینواسیدها استفاده میشد اما از آنجا که کار با HF برای جدا کردن پپتید از تکیهگاه جامد و حذف نهایی محافظها خطرناک بود، استراتژی Fmoc/tBu محبوبیت بیشتری کسب کرد.
اگرچه این روش اصلی فعلی برای سنتز پپتیدها است، ابدا کامل و بی نقص نیست.
برای اینکه به حداکثر بازده برسیم باید در هر مرحله آمینواسید، عوامل جفت ساز و باز اضافی وارد کنیم. از طرف دیگر اسیدهای آمینه Fmoc از دید اهمیت به محیطزیست مناسب نیستند.
همچنین برای جداسازی کامل Fmoc از پپتیدها مجبور به استفاده مقادیر زیاد پیپریدین (بیش از 20 برابر) هستیم. بعد از هر عملیات باید مقدار زیادی حلال برای شست و شو استفاده شود که همه اینها باعث بالا رفتن نسبت PMI میشود.
-> PMI: نسبت مجموع جرم کلیه مواد ورودی به جرم محصول جدا شده
این ویژگیها نه تنها هزینه تولید را بالا میبرد، بلکه از نظر زیست محیطی و تولید زباله نامطلوب است.
اگر پپتید شما آب گریز باشد مشکلات دیگری هم دارید. پپتیدهای آبگریز علاقه به تجمع در کنار هم دارند که باعث نیاز به حلالها و رزینهای خاص دارد که باز هم شما را از یک تولید سبز دور میکند.
نتیجه اینکه باید به فکر بهتر کردن فرایند سنتز پپتیدها باشیم. بهبود این فرآیند بحث مفصلی است که در این مقاله فرصت توضیح و بررسی آن را نداریم اما می توانید در این مقاله از مجله شیمی آلی بیشتر بخوانید.
جداسازی و خالصسازی پپتیدها
مرحله تصفیه یا جداسازی، گلوگاه تولید است و زبالههای آلی زیادی نیز تولید میکند. در این بخش روشهای مختلف برای خالصسازی را بررسی میکنیم.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC):
HPLC رایجترین تکنیک خالصسازی پپتیدها است. از آنجا که کروماتوگرافی فاز معکوس(RP) و تبادل یونی(IEX) خروجیهایی با وضوح بالا، مقاوم و قابل باز تولید ایجاد میکنند، برای تصفیه پپتیدها استفاده میشوند.
توجه داشته باشید که برهمکنش پپتیدها با ستونهای کروماتوگرافی تفاوت زیادی با مولکولهای آلی کوچک دارد. ستونهای کروماتوگرافی حالت مختلط (MMC) در بازار موجودند که رهمکنشهای مختلفی داشته و برای جداسازی پپتیدها کاربرد دارند. این نوع کروماتوگرافی میتواند جایگزین یا مکمل RP، IEX یا فاز طبیعی در خالصسازی پپتیدها باشد.
کروماتوگرافی مایع فوق بحرانی (SFC):
SFC مزایا مختلفی نسبت به HPLC سنتی نشان میدهد. از جمله: سرعت، استفاده کاربردی از ستونهای بلندتر، مکانیسم نگهداری فاز طبیعی و کاهش مصرف حلالها.
از این تکنیک میتوان برای تصفیه پپتیدهای خطی و حلقوی تا سقف 40مر استفاده کرد.
SFC از CO2 به عنوان فاز متحرک همراه با اصلاحکنندهها (مثل متانول، اتانول و...) و مواد افزودنی (مثل TFA یا آمونیوم استات) استفاده میکند. انتخاب مواد افزودنی با توجه به پپتیدی که قصد جداسازی آن را دارید، بستگی دارد.
از مزایای این روش میتوانیم به موارد زیر اشاره کنیم:
👈 کمتر از یک سوم روشهای تصفیه فعلی، زباله آلی تولید میکند.
👈 اصلاحکنندههای آن کمتر سمی هستند.
👈 تفکیک بهتر با ترکیبات کایرال
👈 ویژگیهای CO2: غیر قابل اشتعال، غیرسمی و...
👈 امکان بازیافت و استفاده مجدد از CO2 مصرفی
نکات منفی را هم از قلم نندازیم، سرعت بالای جریان باعث ایجاد گرما میشود که میتواند توانایی تفکیک را تحت تاثیر قرار دهد و همچنین مطالعات زیادی در مورد خالصسازی پپتیدها با این روش موجود نیست.
استخراج مایع - مایع (LLE):
این روش را با نام استخراج حلال هم میشناسند و قدیمیترین و پرکاربردترین روش برای جداسازی واسطهها در سنتز پپتید فاز محلول(LPPS) است. طی سالهایی که گذشت تغییراتی برای بهبود بازده این روش و کاهش مصرف حلال و هزینهها صورت گرفت.
نمونههایی از این روش را میتوانیم در سیستم جریان مداوم، چرخش میکروقطره در هیدروسیکلون و... ببینیم اما هیچ کدام از این روشها به طور گسترده برای پپتیدهای مصنوعی استفاده نشده و یا دست کم نتایج منتشر نشده اند.
از طرف دیگر، یک استخراج مایع یونی-حلال آلی برای خالصسازی دیپپتیدها و تریپپتیدها صورت گرفته است که نتایج عالی ای را نشان داد و از مزیت بازیافت مایعات یونی نیز استفاده کرد.
رابطه میزان خلوص پپتیدها و کاربرد
خلوص پپتید را به صورت درصدی از پپتید هدف نسبت به ناخالصیها با جذب معادل پیوند پپتیدی(210-220nm) تعریف میشود. سطوح مختلفی از خلوص تجاری با توجه به کاربرد در دسترس هستند که به شرح زیر اند:
>95% - مطالعات کمی مانند NMR، مطالعات اتصال گیرنده-لیگاند، ELISA و RIA، تولید آنتیبادی مونوکلونال، مطالعات in vivo
>80% - غربالگری با بازده بالا، انسداد غیر کمی در آزمایشهای ایمونوهیستوشیمی(IHC) و آنالیز وسترن بلات، مطالعات آنزیم-سوبسترا غیر کمی، تصفیه میلی آنتیبادی و پوشش صفحه برای اتصال سلول
>70% - استانداردهای ELISA، سنجشهای ELISPOT و تولید آنتیبادی پلی کلونال
در آخر
در این مقاله از کاربردهای پپتیدهای مصنوعی سفرمان را شروع کردیم، به فرآیند سنتز و استراتژیهای تولید پرداختیم و در خالصسازی به پایان رسیدیم. سعی کردیم به یک دید کلی از این فرآیندها برسیم. همچنین با توجه به گستردگی موضوع، کلیدواژهها و سرنخهایی ارائه کردیم تا خودتان پیگیر شوید و به یادگیری ادامه دهید.
اگر بحث طراحی پپتیدها و کاربردهایشان برایتان جالب است، احتمالا بخواهید سری هم به دوره طراحی و فرمولاسیون محصولات کازمتیک: محصولات پپتیدی پوست بزنید.
0 نظر