توسعه رده های سلولی: مراحل و بهینه سازی

🧬مبحث: بیوتکنولوژی

📝مقاله قبلی: اصول در عرصه عمل;کیفیت در محصولات بیوتکنولوژی

📝مقاله بعدی: در تاسیسات بانک سلولی چه می‌گذرد؟

💻مدرسه تکمیلی: مدرسه مقدماتی و پیشرفته بیوتکنولوژی

🖊شماره مقاله: 11

هنریتا لکس فقیر، سیاه پوست و در آستانه‌ی مرگ بخاطر سرطان دهانه رحم بود. ژانویه‌ 1951 بود که به کلینیک سرطان جان هاپکینز، تنها بیمارستان برای درمان آمریکایی‌های آفریقایی تبار در بالتیمور رفت تا عضوی باشد از یک حرکت تاریخی در صنعت بیوتکنولوژی و آغازی برای توسعه‌ی رده‌های سلولی.

در آزمایشگاه‌ها به طور معمول سلول‌های سرطانی قبل از انجام مطالعات مناسب چند بار تقسیم می‌شدند و از بین می‌رفتند.

اما جورج اوتو گی پزشک و محقق سرطان در آن بیمارستان متوجه شد که میل به جاودانگی سلول‌های سرطانی هنریتا بیش از این حرف‌هاست و به شرطی که مواد مغذی مناسب را در اختیار آن قرار دهند می‌تواند بدون استراحت به تقسیمات سلولی خود ادامه دهند.

نتایج این آزمایشات منجر به تواید اولین رده سلولی انسانی شد که به افتخار هنریتا سلول‌های HELA نامیده شد. سلول‌های هلا از آن زمان تا کنون در عرصه تحقیقات بیولوژیکی خوش درخشیدند.

برای مثال سال 1954 بود که Jonas Salk با کمک رده‌های سلولی توانست واکسنی برای فلج اطفال تولید کند و در دهه 1980 محققان از آن برای شناسایی و جداسازی ویروس نقص ایمنی اکتسابی یا HIV استفاده کنند.

در سال‌های اخیر نیز رده‌های سلولی سردمدار انقلاب omics از ژنومیک تا رونویسی و پروتئومیکس هستند.

از کاربردهای رده‌ سلولی هم مشخص است نمی‌توانید پا به دنیای بیوتکنولوژی بگذارید و از قید اطلاعات پایه توسعه رده‌های سلولی بگذرید.

برای همین در این مقاله نگاهی می‌اندازیم به تعریف، تاریخچه، چالش‌های رده‌های سلولی انسانی، بازار، مراحل توسعه، بهینه‌سازی و تولید رده‌های سلولی.

برگی جدید از کتاب دایره المعارف ژنتیک به اسم رده‌های سلولی

وقتی حرف از جاودانگی و فناناپذیری به میان می‌آید بیشتر یاد چه چیزی می‌افتید؟

احتمال اینکه در این شرایط دریچه‌ی تخیلتان را باز کنید و اسامی گرگینه‌ها، خون‌آشام‌ها و جادوگران داستان‌ها که فناناپذیر بودند را به یاد بیاورید، خیلی بیشتر از این است که رده‌های سلولی در تصورتان نقش ببندد!

اما این بار دایره المعارف ژنتیک، رده سلولی را به ما معرفی می‌کند که می‌توانند اندازه‌ی تمام خون‌آشام‌های ذهنتان جاودانه باشند، البته در دنیای واقعی!

به قول دایره‌ المعارف ژنتیک، رده‌های سلولی، یک کشت سلولی دائمی هستند که با داشتن فضا و محیط تازه و مناسب، به طور نامحدود تکثیر خواهد شد. رده‌ها از نظر جاودانه شدن با سویه‌های سلولی تفاوت دارند.

آن‌چه گذشت سریال رده‌های سلولی و فناوری کشت سلول قبل از قسمت سلول‌های HELA

در آینده‌ خواهید دید! بعد از سلول‌های hela چه به روز سریال رده‌های سلولی آمد؟

از ورود انقلابی سلول‌های HELA تا همین چند سال پیش، حدود 70000 مطالعه در مورد کابردهای این سلول‌های فناناپذیر صورت گرفت.

دست کم دو جایزه نوبل نتیجه‌ی این حجم از مطالعات در مورد سلول‌های Hela بود. یکی از این جوایز نتیجه‌ی تلاش‌های هارالد زور هاوزن در سال 2008 برای بررسی تاثیر این سلول‌های بین ویروس پاپیلومای انسانی و سرطان دهانه رحم بود.

دیگری نیز که به الیزابت بلکبرن، کارول گریدر و جک سوستاک در سال 2009 بر روی بخشی از آنزیم تلومراز که در جلوگیری از تخریب کروموزوم‌ها نقش دارد، تعلق می‌گیرد.

محققان در توسعه رده‌های سلولی با چه مشکلاتی دست و پنجه نرم می‌کنند؟

وقتی می‌خواهیم پروتئین‌های انسانی تولید کنیم، استفاده از سلول‌های انسانی منطقی‌تر است اما شرایط چندان هم بر وفق مراد نیست.

اما مشکلات کار با سلول‌های انسانی آن‌قدر هست که حاضر شویم، عطایش را به لقایش ببخشیم.

مثلا این سلول‌ها به سختی ژن جدید قبول می‌کنند، پروتئینشان عملکرد کمی دارد و سرمایه گذاری زیادی را لازم دارند.

اگرچه هنوز به دلایل مشخص در فرآیند تولید واکسن از رده‌های سلول انسانی استفاده می‌شود اما جا برای سیستم‌های بیان پروتئین دیگری مخمر، جلبک، حشره، E.Coli و پستانداران در دنیای تحقیق، توسعه و تولید باز شده است.

💻برای آشنایی بیشتر با میزبان‌های مختلف و تفاوت آن‌ها می‌توانید وبینار تولید پروتئین‌های نوترکیب از سلول تا بیوراکتور را تماشا کنید.

شرکت‎‌هایی که در بازار توسعه رده‌های سلولی پادشاهی می‌کنند.

✔ رشد تولید واکسن در سراسر جهان

✔ افزایش شیوع سرطان در کشورهای پیشرفته

✔ رشد صنایع بیوتکنولوژی در جهان

✔ نوآوری در زیست‌شناسی به خاطر انقضا حق اختراع‌ها

✔ افزایش تقاضا برای مونوکلونال آنتی‌بادی‌ها

✔ فناوری‌های جدید در توسعه رده‌های سلولی

همه و همه دست به دست هم داند تا بازار 4.3 میلیارد دلاری رده‌های سلولی در سال 2019 به حدی پیشرفت کند که تا سال 2026 ارزشی معادل 9.9 میلیارد دلار برای آن در نظر بگیرند.

در مقابل رگولاتوری پیچیده و مشکلات موجود در تحقیقات سلول‌های بنیادی از جمله چالش‌هایی هستند که فعالان این حوزه باید در نظر بگیرند.

خالی از لطف نیست که با برخی از بازیگران اصلی در بازار جهانی توسعه رده‌های سلولی که Global Market Insights معرفی کرده است، آشنا شوید:

American Type Culture Collection (ATCC)
Lonza Group AG
Thermo Fisher Scientific, Inc
GE Healthcare
Sigma-Aldrich Corporation
Selexis SA
European Collection of Cell Cultures (ECACC)
Corning, Inc
WuXi AppTec, Inc
Sartorious AG

در یک لقمه با مراحل ایجاد یک رده سلول نوترکیب آشنا شوید!

جریان رده سلولی معروف چو چیست؟

در بحبوحه‌ی جنگ داخلی چین در سال 1984 بود که واتسون برای ادامه‌ انجام تحقیقات در مورد مالاریا و اپیدمیولوژی چمدانش را بست و با تنها هدیه‌ایش یعنی 10 جفت همستر چینی فرار کرد.

شونتکر از واتسون خواست تا به گونه جدیدی که با خود آورده دسترسی داشته باشد و اینگونه بود که اولین کلونی این حیوان، بیرون از چین، تاسیس شد.

پاک دانشمندی بود که با موفقیت سلول‌های HeLa را کلون کرده بود اما وقتی در کار با آن به بن‌بست خورد به یک راه جدید رو آورد.

پاک تصمیم گرفت از تخمدان همستر چینی خود نمونه برداری کند و آن را در ظرف پتری قرار دهد. او دید که سلول‌ها به سرعت و پایدار رشد می‌کنند و به خاطر منشا همستر، خطر آلودگی با ویروس‌های انسانی کاهش یافته است.

در ادامه راه، وقتی که سلول E. coli معروف، در تولید یک فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی شکست خورد، چو قدرت سیستم بیان پروتئین خود را به نمایش گذاشت و لقب The mammalian E. coli را به دست آورد.

امروزه بیش از 70% پروتئین‌های نوترکیب از این رده‌های سلولی ایجاد می‌شوند. شرکت‌های بسیاری با سلول‌های چو کار کرده و می‌کنند پس مسیر نظارتی واضح است و به تولیدکنندگان اطمینان می‌دهد که می‌توانند محصول خود را از مسیر مشخصی به بازار برسانند.

علاوه بر مسئله رگولاتوری، این سلول‌ها مزایای علمی خوبی نیز فراهم می‌کنند. آن‌ها می‌توانند در محیط سوسپانسیون و بدون نیاز به سرم یا محیط با منشا حیوانی رشد کنند.

جدا از آسان بودن رگولاتوری، این سلول‌ها ویژگی‌هایی دارند که تولیدکنندگان به دنبالش هستند. رده CHO می‌تواند در یک محیط رشد شیمیایی مشخص رشد کند و به مقیاس بالا برسد و نیازی به صرف هزینه برای سرم یا محیط با منشا حیوانی ندارد.

از همه مهم‌تر قدرت بیان پروتئین چو است. این سلول قدرت تولید حجم بالایی از پروتئین را با گلیکوزیلاسیون "شبیه انسان" دارد و تاثیر به سزایی در جلوگیری از واکنش سیستم ایمنی بیمار در برابر دارو می‌گذارد.

همه این‌ها دست به دست هم دادند تا چو تبدیل به یک میزبان عالی شود. البته به جای چو درست‌تر است بگویم خاندان چو!

با این خانواده‌ی پرکابرد در صنعت آشنا شوید:

آستین‌ها را بالا بزنید! وقت بهینه‌سازی فرایندهای توسعه رده سلولی فرا رسیده.

جون دمپسی مدیر عامل و هم بنیانگذار Pathway Biopharma، چهار راه برای بهینه کردن فرآیند توسعه رده‌های سلولی معرفی می‌کند:

تکامل هدایت شده؛ فرمان تکامل را به دست بگیرید!

معمولا برای مدیریت رده‌های سلولی، در زمان توسعه از چندین مرحله اسکرینگ استفاده می‌شود تا خصوصیات مختلف سلول مثل بهره‌وری و رشد، مشخص شود.

یک روش کارآمدتر برای تولید سلول میزبان پیشنهاد می‌شود و آن تکامل هدایت‌شده است.

همانطور که از اسمش بر می‌آید، قرار است فرمان تکامل رادر دست بگیریم. در این روش شما به فرآیندهای خط تولید خود نگاه می‌کنید و کلونی‌هایی را که با بخشی از شرایط شما سازگاری دارند را جدا و به عنوان والد جدید انتخاب می‌کنید.

در این چرخه انتخاب والدهای جدید و جهش را انقدر ادامه می‌دهید که به رده سلول نهایی برسید. در آخر سلولی دارید که برای خط تولید شما بهینه شده است.

📝برای مطالعه تکمیلی این مقاله از NATURE را مطالعه کنید.

وکتور مصنوعی؛ برخوردی سیستماتیک با طبیعت در توسعه رده‌های سلولی

استفاده از وکتورهای ویروسی و endogenous خیلی معمول است اما این وکتورها گاهی رفتارهای غیرقابل پیش‌بینی و کنترل دارند که مناسب فرآیندهای صنعتی نیست.

پروموترهای مصنوعی نقش ربات‌های برنامه‌ریزی شده‌ای را دارند که رفتارهای یکسان و قابل پیش‌بینی از خود نشان می‌دهند.

چندین شرکت و گروه دانشگاهی در حال طراحی پروموترهای کاملاً مصنوعی و سایر عناصر ژنتیکی برای مهندسی سلول CHO هستند. برای مثال شما می‌توانید پروموتر خاصی طراحی کنید که تنها در بافت یا شرایط خاصی فعال شود.

📝مقاله استراتژی جامع ساخت پروموترهای مصنوعی خاص بافت سبز دو طرفه می‌تواند شما را با طراحی پروموترهای مصنوعی مخصوص بافت‌های خاص بیشتر آشنا کند.

با اتوماسیون از تکنیک‌های دستی خداحافظی کنید

دستورالعمل‌های رگولاتوری از شما می‌خواهند که رده سلول شما از یک سلول ایجاد شود. یعنی ژنوم همه سلول‌ها یکسان باشد.

انتخاب یک کلون پایدار با میزان تولید مناسب یک چالش جهانی در این حوزه است، به خصوص که تکنیک‌های توسعه تک سلول‌ها خود بر زنده ماندن سلول اثر می‌گذارد.

به شکل سنتی، کلونینگ تک سلول فرآیندی دستی و زمان‌بر بود. سلول‌ها به صورت دستی در صفحات کشت توزیع می‌شدند و با بررسی بصری به کمک میکروسکوپ، شناسایی می‌شدند.

بیایید سری به روش‌های سنتی بزنیم:

رقیق‌سازی متوالی (Limiting dilution)

یک روش گسترده برای کلونینگ تک سلولی است. در این روش سلول‌ها را رقیق می‌کنند، در صفحه کشت قرار می‌دهند و منتظر می‌مانند.

این راه مستعد آلودگی و بسیار زمان‌بر است. از آنجا که این کار بر احتمالات برجاست، برای تایید آن نیاز است دست کم دو بار صورت بگیرد.

فلوسیتومتری یا مرتب‌سازی سلول فعال‌شده با فلورسانس(FACS)

فلوسایتومتری روش دیگری است که بر اساس بیان پروتئین سطح سلول کار می‌کند.

این روش با اینکه پیچیده است و می‌تواند به سلول آسیب بزند اما به ما این امکان را می‌دهد که غربالگری مرتب‌سازی را با راندمان بالایی داشته باشیم.

اتوماسیون‌های مختلفی در این زمینه توسعه یافتند. مثلا:

ClonePix™

ابزاری است که به طور خودکار، کلونی موجود در محیط‌کشت نیمه جامد را برداشت و از آن تصویربرداری می‌کند.

از این تصاویر برای شناسایی بهترین کاندیدها استفاده می‌شود. البته این ابزار بدون مشکل هم نیست و محیط کشت نیمه جامد آن رشد سلول را با اختلال مواجه کند.

Cyto-Mine®

پلتفرم آنالیز تک سلول است که یک دیدگاه متفاوت و ابتکاری برای جداسازی سلول‌های منفرد ارائه می‌دهد.

این پلتفرم به سرعت صدها هزار سلول منفرد را به شکل قطره‌های منفرد جدا می‌کند. سلول‌ها بر اساس بهره‌وری انتخاب می‌شوند و برای ایجاد شواهد بصری یکنواخت تصویربرداری با سرعت بالا صورت می‌گیرد.

نتیجه چیست؟ صرفه‌جویی در وقت و هزینه.

وقت طلاست. از سرعت رشد غافل نشوید!

یکی از مشکلاتی که توسعه دهندگان رده‌های سلولی با آن مواجه هستند این است که سلول‌ها میل چندانی به جدا شدن از هم ندارد.

برای مثال سلول‌های CHO ترکیبات سیگنالینگ را ترشح می‌کنند که خود تحریک هستند اما می‌توانند به عنوان یک محرک خارجی برای رشد کلی سلول هم عمل کنند.

اما خدا روزی را نیارد که این محرک‌ها به اندازه کافی وجود نداشته باشند. در چنین شرایطی جدا کردن تک سلول‌ها با مشکل مواجه می‌شود که تاثیر قابل توجهی در رشد و تکثیر سلول‌ها می‌گذارد.

حالا در این شرایط اگر بخواهید محیط کشت را زیاد تغییر دهید خود عامل اختلالی می‌شود که می‌تواند جلوی رشد سلول‌ها را بگیرد.

یک خبر خوب و یک خبر بد!

اول خبر بد:

روشی متناسب با رشد و توسعه همه تک سلول‌ها نداریم؛ انواع مختلف سلول‌های چو نیازهای تغذیه خاص خود را دارند.

خبر خوب اینکه انواع مختلفی از محیط‌های کشت برای سلول‌های مختلف بهینه شده‌اند که برای رهایی از این مشکلات به شما دست یاری می‌دهند.

درآخر

با اصول پایه ای از توسعه رده‌های سلولی آشنا شدیم و در مورد بهینه‌سازی آن اطلاعات کسب کردیم. پیشرفت بیشتر در این زمینه به طور مستقیم بر صنعت بیوتکنولوژی موثر است و همین دلیلی بر اهمیت آن است.

البته باید توجه داشت که کشت و توسعه سلول‌ها فراتر از آنچه گفته شد کاربرد دارد که در این مقاله فرصت اشاره به آن‌ها نبود.

اگر علاقمند آشنایی بیشتر با این حوزه هستید وبینار انتقال ژن به سلول جانوری به شما کمک خواهد کرد.